LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES LUHS LIBRARY REPOSITORY

Nervinio ir raumeninio audinio embrioninės raidos ypatumų tyrimas

Show simple item record

dc.contributor.author Norkutė, Akvilė
dc.date.accessioned 2017-08-21T08:07:39Z
dc.date.available 2017-08-21T08:07:39Z
dc.date.issued 2009
dc.identifier.uri http://repository.lsmuni.lt/handle/1/60151
dc.description.abstract Pastaruoju metu tyrimams dažniausiai naudojami žinduoliai, kadangi rezultatai šiek tiek atspindi žmogaus organizme vykstančius procesus. Šis darbas parengtas analizuojant besivystančias paukščio embriono sistemas: tai būdas, leidžiantis sutaupyti lėšų bei dėka trumpo embrioninio vystymosi laikotarpio suteikiantis galimybę operatyviam rezultatų gavimui. Iki šiol literatūroje neradome duomenų apie pirmojo raumens susitraukimo ypatybes, o šį procesą įtakojančios nervų sistemos vystymąsi apibūdina keletas hipotezių. Taigi darbo tikslas buvo išsiaiškinti pirmojo susitraukiančiojo raumens atsiradimo laiką, jo morfologiją (1) ir išanalizuoti ankstyvajame embriogenezės laikotarpyje kontraktilų aparatą įtakojančios nervų sistemos vystymosi ypatumus (2). Tyrimams naudojome kalakuto ir vištos embrionus – kadangi skirtingų porūšių skirtumai mums nebuvo svarbūs, palyginimas tarp minėtų paukščių embrionų neatliktas. Embrionai buvo stebimi in vivo, tyrimams in vitro atlikti buvo naudojami šie molekulinės biologijos metodai: paruoštų pjūvių dažymas histo- ir imunohistochemiškai, polimerazės grandininės reakcijos, ląstelių kultūrų auginimas ir Western blotas. Pirmasis aktyvus raumens susitraukimas kalakuto embrione atsiranda 19-22 Hamburgerio Hamiltono stadijoje, t.y., praėjus 116 val. nuo inkubacijos pradžios: porinis raumuo sudarytas iš keturių susiliejusių miomerų, yra 1 mm ilgio ir 0,1 mm pločio – šis iš dviejų ląstelių tipų sudarytas audinys atsakingas už pirmuosius aktyvius embriono susitraukimus, pirmiausia atsirandančius pakaušinėje - kaklinėje srityje. Kadangi toks pirmasis raumuo literatūroje nebuvo aprašytas, jam suteiktas vardas musculus occipitalis primordialis. Embrionui lyg skeletas tarnaujanti stuburinė styga arba notochorda yra elastinga struktūra, kurios morfologija įvairiuose embriono regionuose yra skirtinga: kaklinėje ir kaudalinėje dalyje chordos diametras mažesnis nei embriono centre. Manoma, kad būtent dėl to notochorda šiose srityse yra elastingesnė, o dėka savo elastingumo padeda susitraukusiam raumeniui grįžti į pradinę būseną. Pirmojo raumens susitraukimas paskatino susimąstyti, kiek toli šiuo periodu yra pažengęs nervų sistemos vystymasis. Egzistuoja skirtingos neuronų ir glijos ląstelių vystymosi teorijos. Klausimas, ar glija gali egzistuoti kaip nepriklausoma ląstelių populiacija, vis dar tebediskutuojamas. Keliomis tyrimų metodikomis įrodėme, kad astrocitai – vienas glijos ląstelių tipas – egzistuoja savarankiškai jau ketvirtąją embrioninio vystymosi parą. Šiuos rezultatus patikrinome polimerazės grandininėmis reakcijomis, astrocitų kultūrų tyrimais bei Western blotu, leidžiančiu nustatyti baltymines struktūras. Vienas mūsų darbo tikslų buvo išanalizuoti vištos smegenų regioninius skirtumus. Visuose tirtuose smegenų regionuose, išskyrus kaudalinę nervinio vamzdžio dalį, glijos skaidulinio baltymo (GFAP) geno raiška ketvirtąją embrioninio vystymosi dieną buvo didesnė nei septintąją parą. Procesui tęsiantis, besivystančios smegenys išskiria panašų GFAP kiekį, tačiau reliatyvus GFAP ląstelių skaičius buvo aukštesnis ketvirtąją vystymosi parą. GFAP geno raiškos sumažėjimas tarp 4-osios ir 7-osios parų gali būti sąlygotas kitų proliferuojančių ląstelių (galbūt neuronų – galima hipotezė, jog neuronai diferencijuojasi truputį vėliau nei astrocitai) skaičiaus didėjimo. Kaip buvo tikėtasi, vėlyvose stadijose (19-ąją vystymosi parą) GFAP geno ekspresija buvo itin didelė. Tai, matyt, reiškia pasibaigusią neurogenezę ir vis dar besitęsiantį astrocitų vystymąsi. Astrocitų funkcinio žymens GLAST geno raiškos didėjimas nebuvo tolygus GFAP raiškos pokyčiams. Tokie rezultatai gali būti aiškinami tuo, kad GFAP yra daugiau struktūrinis astrocitų žymuo, tuo tarpu GLAST labiau išreiškia funkcines astrocitų savybes. Vėlyvesnės GLAST geno išraiškos kaudalinėse nervinio vamzdžio dalyse siūlo idėją, kad funkciškai astrocitai vėliau subręsta vidurinėje ir kaudalinėje nervinio vamzdžio dalyse.Imunohistocheminiai tyrimai atskleidė, kad neuronų vystymasis koreliuojasi su astrocitų raida. Ląstelių pirmtakių žymens nestino ir su mikrovamzdeliais susijusio baltymo (MAP2) raiškos analizė bei imunohistocheminis tyrimas, panaudojant SMI 312 antiserumą, buvo atliekamas, norint įsitikinti, kad ketvirtąją embrioninio vystymosi dieną vyksta ir neuronų vystymosi procesai. Neuroepitelinės kamieninės ląstelės išskiria tarpinių filamentų baltymą nestiną, kurio raiška mažėja iš proliferuojančių kamieninių ląstelių vystantis neuronams. Todėl mes pasirinkome abu žymenis neurogenezės procesams ištirti ir aprašyti. Būtent MAP2 raiškos didėjimas tarp ketvirtosios ir septintosios vystymosi dienos bei charakteringas SMI 312 ląstelių pasiskirstymas CNS septintąją vystymosi dieną leido mums teigti, kad jau ankstyvosiose vištos embriono raidos stadijose neurogenezė progresuoja. Tarp ketvirtosios ir septintosios vystymosi parų nepakitusi nestino raiška reiškė, kad proliferuojančios kamieninės ląstelės dar nebaigusios mitozės etapo, o tai reiškia, kad neurogenzės procesas taip pat dar tęsiasi. Oligodendrocitų raida buvo tiriama PGR metodu, analizuojant ląstelių pirmtakių ir subrendusių, jau mielinizuoti galinčių oligodendrocitų genų raiškas. Rezultatai parodė, kad ląstelės pirmtakės egzistuoja visose tirtose embriono srityse, PDGFRα geno raiška išliko ir embriono stadijose prieš išsiritimą. Tai gali reikšti, kad visose embrioninės raidos stadijose egzistuoja ląstelės, iš kurių gali vystytis nauji oligodendrocitai. Geno, leidžiančio nustatyti subrendusias, mielinizuoti galinčias ląsteles, raiška vystymosi metu kito labai intensyviai: pirmuosius du vystymosi trečdalius ji išliko panaši visuose regionuose, o stadijoje prieš išsiritimą padidėjo keliasdešimt kartų. Tai, matyt, reiškia, kad mielinizacijos procesas intensyviau vyksta jau beveik susiformavus nervų sistemai. Kaip procesai nervų sistemoje vyksta anksčiau, t.y., iki ketvirtosios vystymosi paros, atsakyti sunku. Atlikus pirmuosius embrionų preparavimo darbus, tapo aišku, kad tiksliai atskirti besivystančias CNS dalis galima pradedant tik ketvirtąja embrioninio vystymosi diena. Tokiu būdu buvo nagrinėjamos kitos diskusijų vis susilaukiančios CNS vystymosi problemos, o į klausimą, kaip nervų sistema formuojasi nuo pat kiaušinėlio apvaisinimo, ir kaip tai įtakoja raumenų kontrakciją, galėsime bandyti atsakyti vėliau.
dc.description.abstract The purpose of the study was to characterize the first contraction of an isolated muscle in turkey embryo and to determine whether at early stages of chicken brain development during neurogenesis, cells from the astrocytic lineage are present in relevant amounts, where they are located in the neural tube, and to what extend brain regional differences exist. MATERIAL AND METHODS. From the 3rd day of incubation on until the 6th day the embryos were continuously watched through a cellophane window in the eggshell. For histology the embryos were fixed in Bouin's fluid, then completely cut in serial sections of 5 microm thickness and stained according to Masson-Goldner's trichrome procedure plus resorcin-fuchsin. For gene expression analysis markers for stem cells, neurons and astrocytes were used. Immunohistochemistry was made against SMI 312 and GFAP antibodies and Western blot against GFAP as well. RESULTS. A paired muscle 1 mm long and 0.1 mm broad, derived by fusion of the four occipital myomeres, is responsible for the first individual contraction. The contraction produces a stretching in the neck region. The muscle named M. occipitalis primordialis consists of four end-to-end connected groups of mononucleated muscle cells. The muscle contains two types of cells according to the cell nuclei. The elastic rod-shaped notochord represents an endoskeleton. Immediately after contraction it brings the body of the embryo back into its former shape. We also demonstrate that specific markers for astrocytes, i.e. glial fibrillary acidic protein (GFAP) and glutamate-aspartate transporter (GLAST), are expressed and translated during early neurogenesis in the developing chicken embryo already at day 4 in the investigated brain regions. Between day 4 and 7, GFAP expression declines and increases after day 7 again. This profile is not entirely paralleled by GLAST expression suggesting a later acquisition of this functional glial property. Comparison of different brain regions revealed that caudal parts of the developing chicken central nervous system are delayed in development with respect to the switch from neuronal to glial genesis. CONCLUSION. Vital observation accompanying serial section examination showed to be a suitable approach to biomechanical investigations in embryology. It allowed even after nearly 180 years of intensive morphological studies of avian embryos to find a new, up till now not described muscle. We also show that gliogenesis occurs much earlier in the embryonic chicken brain than hitherto assumed.
dc.language.iso lit
dc.subject Pirmasis okcipitalinis raumuo
dc.subject Notochorda
dc.subject Nervų sistemos vystymasis
dc.subject Embrionas
dc.subject Astrocitai
dc.subject Musculus occipitalis primordialis
dc.subject Notochord
dc.subject Neurogenesis
dc.subject Astrogenesis
dc.subject Nerve system development
dc.title Nervinio ir raumeninio audinio embrioninės raidos ypatumų tyrimas
dc.title.alternative Analysis of peculiarities of nervous and muscle tissues development in early embryogenesis
dc.type Daktaro disertacija


Files in this item

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record

Search repository


Browse

My Account